肝病在世界范圍內(nèi)普遍存在。當(dāng)它到達(dá)末期時(shí)，死亡率上升到50%或更多。盡管肝移植已成為終末期肝病最有效的治療方法，但其應(yīng)用受到供體肝臟稀缺的限制。缺乏可接受的供體器官意味著患者在等待合適的肝臟時(shí)處于高風(fēng)險(xiǎn)之中。在這種情況下，細(xì)胞療法已成為一種很有前途的治療方法。

大多數(shù)情況，移植細(xì)胞可以替代宿主肝細(xì)胞并重塑肝臟微環(huán)境。例如，來(lái)自供體肝臟的肝細(xì)胞或干細(xì)胞在肝臟中定植和增殖，可以替代宿主肝細(xì)胞，恢復(fù)肝功能。其他候選細(xì)胞療法，如巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，可以重塑肝臟微環(huán)境，從而修復(fù)受損的肝臟。

近年來(lái)，細(xì)胞療法已從動(dòng)物研究轉(zhuǎn)向早期人體研究。近日，浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院等在《Stem Cell Research&Therapy》國(guó)際期刊中發(fā)表了一篇《終末期肝病的細(xì)胞治療：替代與重塑》的文獻(xiàn)綜述。

在這篇綜述中，我們將討論終末期肝病治療中的干細(xì)胞療法，尤其關(guān)注用于細(xì)胞移植的各種細(xì)胞類(lèi)型，并闡明所涉及的過(guò)程。此外，我們還將總結(jié)細(xì)胞療法的實(shí)際障礙并提供潛在的解決方案。

細(xì)胞療法的多種細(xì)胞來(lái)源和治療部位

肝小葉基本呈六邊形，門(mén)脈三聯(lián)體（門(mén)靜脈、膽管和肝動(dòng)脈）位于小葉的外圍，中央靜脈位于中間。肝細(xì)胞作為肝臟的原代實(shí)質(zhì)細(xì)胞，承擔(dān)著肝臟的大部分生理功能，并由于肝臟強(qiáng)大的再生能力而維持一定的肝體比。因此，可以將肝細(xì)胞植入肝臟以促進(jìn)肝臟再生，這意味著移植的肝細(xì)胞會(huì)增殖并取代宿主肝細(xì)胞（圖1)。

然而，肝細(xì)胞的獲取和保存是一個(gè)普遍的問(wèn)題。為了獲得更多的肝細(xì)胞，一些團(tuán)隊(duì)逐漸開(kāi)始使用干細(xì)胞或具有干細(xì)胞特性的可轉(zhuǎn)分化或分化為肝細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植（圖1）。例如，膽管上皮細(xì)胞(BEC) 可以轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，我們認(rèn)為這是由于細(xì)胞可塑性。標(biāo)記BEC表明，在嚴(yán)重肝損傷的情況下，這些細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞，暗示它們可能是可移植細(xì)胞的來(lái)源。

在最近的研究中，源自膽管細(xì)胞的肝外類(lèi)器官已被證明可以在移植后保持人膽管樹(shù)內(nèi)的可塑性，并且可以修復(fù)人肝內(nèi)膽管。在進(jìn)一步的研究中，多能干細(xì)胞（PSCs）和胎肝祖細(xì)胞可能在體外分化為肝細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞用于細(xì)胞治療，這將在后面詳細(xì)描述（圖1）。

細(xì)胞移植前，膽管上皮細(xì)胞、多能干細(xì)胞和胎肝祖細(xì)胞必須在體外分化為肝細(xì)胞。移植后，這些細(xì)胞在肝臟內(nèi)增殖并取代宿主肝細(xì)胞。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和造血祖細(xì)胞可以重塑肝臟微環(huán)境。肝臟、脾臟和腹膜都是細(xì)胞移植的潛在部位

除了替換宿主肝細(xì)胞和在肝臟內(nèi)擴(kuò)張外，移植細(xì)胞還可以重塑肝臟微環(huán)境（圖1）。例如，移植細(xì)胞可以對(duì)終末期肝病發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗纖維化作用。

此外，已經(jīng)表明，骨髓移植細(xì)胞在放棄轉(zhuǎn)分化時(shí)，可能會(huì)刺激肝細(xì)胞增殖并恢復(fù)肝功能。總之，移植細(xì)胞可以通過(guò)更換宿主肝細(xì)胞和重塑肝臟微環(huán)境來(lái)治療肝臟疾病（圖1)。

更換受損的肝臟

肝細(xì)胞

已顯示成體肝細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)張，類(lèi)似于造血干細(xì)胞。根據(jù)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志的病例報(bào)告，一名患有I型Crigler-Najjar綜合征和嚴(yán)重未結(jié)合高膽紅素血癥的10歲女孩通過(guò)門(mén)靜脈輸注7.5×109個(gè)肝細(xì)胞得到有效治療，并且對(duì)患者的治療益處持續(xù)長(zhǎng)達(dá)11個(gè)月，并允許過(guò)渡到原位肝移植（OLT）。此外，肝細(xì)胞移植 (HT) 已被用于治療患有肝臟代謝異常的兒科患者，并且正在進(jìn)行多項(xiàng)調(diào)查以提高細(xì)胞的可用性和安全性。

另一方面，肝細(xì)胞懸液可以安全地進(jìn)入門(mén)靜脈，證明細(xì)胞療法比OLT 具有更低的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。斯特羅姆等人。已顯示肝細(xì)胞脾動(dòng)脈輸注對(duì)慢性終末期肝病患者的安全性和治療效果。

急性肝衰竭 (ALF) 是一種罕見(jiàn)的急性疾病，死亡率很高。細(xì)胞療法更適合具有典型肝臟結(jié)構(gòu)的ALF患者。在幾個(gè)研究中心，已經(jīng)進(jìn)行了臨床肝細(xì)胞移植研究。

來(lái)自印度的7名患者接受了來(lái)自26-34周大未出生嬰兒的胎兒肝細(xì)胞腹膜輸注。結(jié)果顯示，HT患者的總生存率比對(duì)照組高10%。比里爾等描述了五名接受脾內(nèi)HT治療的ALF患者。移植后48小時(shí)，5名患者中的3名在HT后的腦病評(píng)分、血氨水平、凝血酶原時(shí)間和總生存率方面均有顯著改善。

總的來(lái)說(shuō)，肝細(xì)胞移植的應(yīng)用顯示出對(duì)終末期肝病的巨大治療潛力。然而，這種方法有局限性。主要挑戰(zhàn)之一是肝細(xì)胞的可用性和植入效率有限，以及制造困難。這些障礙包括難以從供體肝臟中分離出高質(zhì)量細(xì)胞、在維持活力的同時(shí)冷凍保存肝細(xì)胞的機(jī)制限制、移植肝細(xì)胞的植入和增殖水平低，以及與細(xì)胞輸送相關(guān)的問(wèn)題。

胎肝祖細(xì)胞

在體外，胎肝祖細(xì)胞（FLPs）可以分化成肝細(xì)胞（圖1）。已經(jīng)表明，來(lái)自人類(lèi)和其他靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的胎兒肝細(xì)胞可能在免疫缺陷小鼠的肝臟中增殖和成熟，重新填充10%的器官。此外，已經(jīng)表明FLP可以分化為功能性人內(nèi)皮細(xì)胞，并且在移植后九個(gè)月內(nèi)未觀察到腫瘤發(fā)展。

多能干細(xì)胞

多能干細(xì)胞 (PSC) 在細(xì)胞移植前需要分化為肝細(xì)胞，被認(rèn)為是HT的替代細(xì)胞來(lái)源（圖1）。為了區(qū)分胚胎干細(xì)胞 (ESC) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC ) ，已開(kāi)發(fā)出多種技術(shù)。ESC來(lái)源于受精后4-5天在人類(lèi)囊胚細(xì)胞簇中形成的多能干細(xì)胞。由于對(duì)ESC的研究由來(lái)已久，一些方案利用細(xì)胞發(fā)育信號(hào)來(lái)促進(jìn)ESC向肝細(xì)胞樣細(xì)胞 (HLC) 的分化。此外，ESC移植后的免疫排斥和ESC獲取的倫理問(wèn)題也是不可避免的問(wèn)題。2013年，許多研究小組使用核移植從患者的體細(xì)胞中有效地創(chuàng)建了ESC，盡管該過(guò)程在技術(shù)上仍具有挑戰(zhàn)性。

類(lèi)器官

類(lèi)器官的應(yīng)用越來(lái)越引起研究人員的興趣?！邦?lèi)器官”被定義為從干細(xì)胞或成體細(xì)胞生長(zhǎng)的三維 (3D) 結(jié)構(gòu)。與二維（2D）細(xì)胞系相比，類(lèi)器官具有器官結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)。合適的類(lèi)器官被認(rèn)為是可用細(xì)胞療法的重要來(lái)源。之前的研究已經(jīng)成功地從Lgr5+細(xì)胞和iPSCs 構(gòu)建了肝臟類(lèi)器官，可用于治療小鼠肝功能衰竭。

武部等據(jù)報(bào)道，移植后，肝臟類(lèi)器官可以重建功能性血管，使小鼠免受藥物性肝損傷 。福布斯等。使用由純化的人膽管上皮細(xì)胞 (hBEC) 構(gòu)建的類(lèi)器官，在膽道疾病小鼠模型中挽救了膽管結(jié)構(gòu)和功能。劍橋大學(xué)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，膽管細(xì)胞類(lèi)器官在人體肝臟移植后可以修復(fù)膽管損傷。

總之，類(lèi)器官在細(xì)胞移植中顯示出巨大的前景。未來(lái)的研究可以應(yīng)用肝臟/膽管細(xì)胞類(lèi)器官治療終末期肝病，并提高擴(kuò)大的肝臟供體庫(kù)中擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體的質(zhì)量。

重塑肝臟微環(huán)境

抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用：除了替換宿主肝細(xì)胞外，移植細(xì)胞還通過(guò)重塑肝臟微環(huán)境來(lái)促進(jìn)LR。重要因素之一是移植細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC) 因其分離、生長(zhǎng)和保存簡(jiǎn)單而常用于臨床。MSC最初是在骨髓中分離出來(lái)的，也可以從臍帶和脂肪組織中獲得（圖2）。

MSCs能夠通過(guò)分泌抗炎因子來(lái)抑制免疫細(xì)胞的增殖和促炎細(xì)胞因子的分泌。MSCs通過(guò)分泌前列腺素E2 (PGE2)、受激基因/蛋白6和吲哚胺2,3-雙加氧酶 (IDO) 來(lái)改善巨噬細(xì)胞的抗炎作用。促炎細(xì)胞因子，如IL-1β和IL-6，也被MSCs抑制。此外，MSCs以IDO依賴(lài)性方式抑制抗體的產(chǎn)生和分泌以及活化B淋巴細(xì)胞的增殖?？傊梢岳肕SCs的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)促進(jìn)肝臟再生。

從骨髓、臍帶和脂肪組織中獲得的MSCs可以通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化子從M1到M2并抑制HSCs來(lái)減少ECM沉積。

抗纖維化：纖維化是終末期肝病的主要表現(xiàn)之一。MSCs和巨噬細(xì)胞能有效緩解肝纖維化和ECM沉積。MSC的主要功能是在LR期間釋放多種營(yíng)養(yǎng)因子以抑制肝星狀細(xì)胞 (HSC) 活化和ECM形成，從而通過(guò)T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)減少纖維化、細(xì)胞凋亡和炎癥（圖2）。

Lin等人的另一項(xiàng)工作。表明MSCs可能會(huì)阻止激活的HSCs的增殖并促進(jìn)它們的死亡。某些臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)慢性肝病患者的治療益處。

根據(jù)Lin等人的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，外周輸注同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于HBV相關(guān)ACLF患者是安全實(shí)用的。通過(guò)增強(qiáng)肝功能和降低嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)，這種治療顯著增加了24周生存期。此外，已經(jīng)表明，通過(guò)肝動(dòng)脈輸注施用的MSC可顯著降低患者的肝纖維化，并導(dǎo)致Child–Pugh評(píng)分顯著改善。然而，相對(duì)于一次移植，肝纖維化在兩次MSC移植后并未惡化。由于這些原因，間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是細(xì)胞治療的潛在細(xì)胞來(lái)源。

肝臟巨噬細(xì)胞是慢性肝損傷病理生理學(xué)中的關(guān)鍵細(xì)胞之一，最近被強(qiáng)調(diào)為可能的抗纖維化靶點(diǎn)。巨噬細(xì)胞在組織損傷后會(huì)發(fā)生顯著的表型和功能變化，并且對(duì)于組織恢復(fù)的啟動(dòng)、維持和解決階段至關(guān)重要。

最近，研究了肝硬化患者對(duì)自體巨噬細(xì)胞輸注治療的反應(yīng)。福布斯等對(duì)9名肝硬化患者進(jìn)行自體巨噬細(xì)胞治療，MELD評(píng)分為10至16 (ISRCTN 10,368,050)。一年之內(nèi)，所有人都還活著并且沒(méi)有進(jìn)行移植，達(dá)到了研究的安全性和可行性的主要目標(biāo)。這項(xiàng)工作為肝硬化和其他纖維化疾病的細(xì)胞治療提供了理論基礎(chǔ)。

總之，間充質(zhì)干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)肝臟的再生至關(guān)重要，可作為細(xì)胞療法的來(lái)源。

組織修復(fù)和再生

細(xì)胞療法的另一個(gè)功能是促進(jìn)組織修復(fù)和再生。造血祖細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中起主要作用。

目前的假設(shè)認(rèn)為，造血祖細(xì)胞治療受損肝臟后的治療改善主要是通過(guò)供體和宿主細(xì)胞之間的旁分泌信號(hào)刺激內(nèi)源性祖細(xì)胞介導(dǎo)的，后者提供細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。

在最近的臨床研究中，接受造血祖細(xì)胞移植的酒精性肝硬化患者取得了持久的治療效果。E.Yannaki等人證明G-CSF在急性肝損傷模型中加速恢復(fù)并提高存活率。在一項(xiàng)大型隨機(jī)對(duì)照臨床研究中，G-CSF與通過(guò)門(mén)靜脈輸注自體造血祖細(xì)胞的組合顯著提高了存活率和肝功能（通過(guò)Child–Pugh評(píng)分和肝臟生物化學(xué)測(cè)量）。然而，接受G-CSF或輸注G-CSF和自體CD133+細(xì)胞的肝硬化患者沒(méi)有明顯的效果。這些臨床研究的多樣性可能源于不同的輸液方案、輸液技術(shù)和劑量。

優(yōu)化細(xì)胞療法的操作

細(xì)胞輸送

肝臟高度血管化；因此，移植細(xì)胞可以通過(guò)幾種不同的途徑給藥，其中門(mén)靜脈或肝動(dòng)脈是最常見(jiàn)的（圖3）。移植的細(xì)胞應(yīng)被輸送到肝竇，在那里它們隨后需要與肝實(shí)質(zhì)整合。最常見(jiàn)的臨床技術(shù)是通過(guò)門(mén)靜脈進(jìn)行細(xì)胞輸注。成人有三種選擇：肝內(nèi)脾靜脈支流穿刺、肝內(nèi)門(mén)靜脈支流穿刺和經(jīng)頸靜脈通過(guò)肝靜脈系統(tǒng)的肝內(nèi)門(mén)靜脈分流術(shù)。

對(duì)于新生兒，通過(guò)臍靜脈插管進(jìn)入。對(duì)于年齡較大的兒童，可以使用腹腔鏡或最小解剖手術(shù)或切開(kāi)法將中央靜脈插管置入門(mén)靜脈支架中。

根據(jù)細(xì)胞的大小，肝細(xì)胞穿過(guò)竇狀靜脈，暫時(shí)阻塞門(mén)靜脈周?chē)軈^(qū)域，隨后通過(guò)血管通透性恢復(fù)正常血流。然而，所有這些治療方案都有出血的風(fēng)險(xiǎn)，特別是對(duì)于經(jīng)常有門(mén)脈高壓、側(cè)支循環(huán)形成和凝血功能障礙的肝病患者。

因此，有兩種可能的解決方案來(lái)管理這個(gè)問(wèn)題：

(1) 連續(xù)多普勒超聲監(jiān)測(cè)以確保門(mén)靜脈壓力不超過(guò)12mmHg和

(2)移植細(xì)胞的肝動(dòng)脈給藥(圖3)。

與門(mén)靜脈方法相反，肝動(dòng)脈通常用作內(nèi)部放射治療和動(dòng)脈化療栓塞的導(dǎo)管，并且可以作為一種更有效的細(xì)胞輸送方式。其他研究提出了替代策略，例如肝硬化患者的脾內(nèi)細(xì)胞輸注和ALF患者的腹膜遞送方法 。這些策略的優(yōu)點(diǎn)是它們?cè)试S功能性肝臟恢復(fù)，同時(shí)防止肝臟免疫排斥。

圖3：肝細(xì)胞移植的優(yōu)化。通過(guò)肝動(dòng)脈或脾臟進(jìn)行的肝細(xì)胞移植可能會(huì)導(dǎo)致更好的定植。

并且肝細(xì)胞到達(dá)肝臟后可能被巨噬細(xì)胞排斥。巨噬細(xì)胞吞噬供體肝細(xì)胞并分泌TGF-β以誘導(dǎo)衰老。在這種情況下，巨噬細(xì)胞可以通過(guò)將供體肝細(xì)胞包裹在水凝膠中來(lái)避免吞噬作用。另一方面，可以通過(guò)照射肝臟或注射血管上皮生長(zhǎng)因子來(lái)增強(qiáng)供體肝細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)

細(xì)胞恢復(fù)和增殖

移植后供體細(xì)胞的活性和增殖能力對(duì)細(xì)胞治療的有效性起著重要作用。肝細(xì)胞保存一直是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。冷凍保存顯著損害肝細(xì)胞，減少ATP生成并下調(diào)整合素-β1和E-鈣粘蛋白。同時(shí)，使用細(xì)胞凋亡抑制劑和胱硫醚抑制劑改善了肝細(xì)胞的活性和功能。

結(jié)論和觀點(diǎn)

隨著全球肝移植需求的增長(zhǎng)，需要更多的研究來(lái)彌合供體肝臟和等待名單患者之間的差距，并改善肝移植受者的長(zhǎng)期預(yù)后。在過(guò)去的幾十年里，細(xì)胞療法取得了顯著進(jìn)步，證明了干細(xì)胞治療肝病的有效性和安全性。在將其用于臨床試驗(yàn)之前，必須解決許多挑戰(zhàn)，包括從供體肝臟中分離出高質(zhì)量的細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞植入以減少免疫反應(yīng)，以及改善植入和長(zhǎng)期結(jié)果。

此外，干細(xì)胞或具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞可用于解決與肝細(xì)胞獲取相關(guān)的挑戰(zhàn)。源自iPSC的HLC和各種細(xì)胞來(lái)源的類(lèi)器官（iPSC、祖細(xì)胞、膽管細(xì)胞）為細(xì)胞治療提供了足夠的細(xì)胞來(lái)源。此外，iPSC和類(lèi)器官在體內(nèi)移植中始終具有更高的生存能力和效率。具有遺傳穩(wěn)定性和高度可擴(kuò)展特性的類(lèi)器官可能是治療終末期肝病的一種有前途的策略。肝臟中的不同細(xì)胞具有更換和重塑肝臟微環(huán)境的作用；

因此，將多種細(xì)胞治療結(jié)合起來(lái)可能是細(xì)胞治療的未來(lái)趨勢(shì)。細(xì)胞療法最顯著的優(yōu)勢(shì)是可以高度靈活地選擇最佳細(xì)胞和移植部位進(jìn)行治療，以滿(mǎn)足患者的需求。

參考資料：Hu, XH., Chen, L., Wu, H. et al. Cell therapy in end-stage liver disease: replace and remodel. Stem Cell Res Ther 14, 141 (2023). https://doi.org/10.1186/s13287-023-03370-z

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